1. سلول هایی که قرار است انجماد شوند باید در حالت رشد خوب (لوگ فاز) و میزان بقای بالا با تراکم حدود 80-90 درصد باشند.
2. بررسی کنید که آیا سلول ها هنوز خواص منحصر به فرد خود را قبل از انجماد حفظ می کنند.
به عنوان مثال، هیبریدوم باید یک تا دو روز قبل از انجماد برای تولید آنتی بادی آزمایش شود.
3. به کیفیت محافظ سرما توجه کنید.
DMSO باید درجه معرف، استریل و بی رنگ باشد (فیلتر شده با تلفلون 0.22 میکرون FGLP یا محصولات استریل خریداری شده مستقیم، مانند Sigma D-2650)، در حجم های کوچک 5-10 میلی لیتر، در دمای 4 درجه سانتی گراد در تاریکی ذخیره شود. چند بار یخ زدایی نکنید. گلیسرول نیز باید از درجه معرف باشد و پس از اتوکلاو در تاریکی نگهداری شود. ظرف یک سال پس از باز کردن استفاده شود، زیرا پس از نگهداری طولانی مدت برای سلول ها سمی خواهد بود.
4. غلظت سلولی برای انجماد:
(1) فیبروبلاست طبیعی انسان: 1~3 x 106 سلول در میلی لیتر
(2) هیبریدوم: 1 ~ 3 x 106 سلول / میلی لیتر، غلظت سلول نباید خیلی زیاد باشد، برخی از هیبریدوم ها پس از ذوب شدن 24 ساعت به دلیل غلظت بالای انجماد می میرند.
(3) خطوط تومور چسبنده: 5 ~ 7 x 106، بسته به نوع سلول. آدنوکارسینوما پس از ذوب شدن به غلظت بالاتری نیاز دارد، در حالی که HeLa تنها به 1-3 در 106 سلول در میلی لیتر نیاز دارد.
(4) سایر سوسپانسیون ها: 5 ~ 10 × 106 سلول / میلی لیتر، لنفوسیت انسانی باید حداقل 5 × 106 سلول / میلی لیتر باشد.
5. غلظت انجماد 5 یا 10 درصد DMSO است. اگر شرایط انجماد سلول‌ها نامشخص است، برای جلوگیری از شکست انجماد باید از کشت پشتیبان در حین انجماد استفاده شود.
6. روش انجماد:
(1) روش سنتی: 4 oC 10 دقیقه ---> -20 oC 30 دقیقه ---> -80 oC 16-18 ساعت (یا یک شب) ---> ذخیره سازی طولانی مدت در فاز بخار مخزن نیتروژن مایع .
(2) خنک‌سازی را برنامه‌ریزی کنید: از یک دستگاه خنک‌کننده با سرعت ثابت برای کاهش دمای اتاق به -120 درجه سانتیگراد با سرعت -1 تا -3 درجه سانتیگراد در دقیقه استفاده کنید و آن را در فاز بخار یک مخزن نیتروژن مایع برای مدت طولانی ذخیره کنید. ذخیره سازی مدت برای حفظ سلول های معلق و هیبریدوم مناسب است.
7. مواد:
(1) سلول های کشت شده که به خوبی رشد می کنند
(2) متوسط تازه
(3) DMSO (Sigma D-2650)
(4) لوله انجماد پلاستیکی استریل (Nalgene 5000-0020)
(5) 0.4% w/v تریپان آبی (GibcoBRL 15250-061)
(6) صفحه هموسیتومتر و شیشه پوشش
(7) دستگاه خنک کننده با سرعت ثابت (KRYO 10 Series II)
8. مراحل:
(1) یک روز قبل از انجماد، نصف یا کامل مقدار محیط را تغییر دهید و رشد سلولی را مشاهده کنید.
(2) تهیه محلول انجماد (تهیه قبل از استفاده): DMSO را به محیط تازه اضافه کنید، غلظت نهایی 5-10٪ است، خوب مخلوط کنید و آن را برای استفاده بعدی در دمای اتاق قرار دهید.
(3) با توجه به عملیات زیر کشت سلولی، سلول های کشت شده را جمع آوری کنید و مقدار کمی سوسپانسیون سلولی (حدود 0.1 میلی لیتر) را برای شمارش غلظت سلولی و میزان بقا قبل از انجماد مصرف کنید.
(4) سانتریفیوژ کنید، مایع رویی را بردارید، مقدار مناسبی از محلول انجماد را اضافه کنید تا غلظت سلولی 1-5 × 106 سلول در میلی لیتر شود، خوب مخلوط کنید و در لوله انجماد برچسب دار، 1 میلی لیتر در ویال بریزید، و یک عدد کوچک بردارید. مقدار سوسپانسیون سلولی برای تشخیص آلودگی
(5) روش انجماد 1: انجماد در دمای 4 درجه سانتیگراد به مدت 10 دقیقه → -20 درجه سانتیگراد به مدت 30 دقیقه → -80 درجه سانتیگراد به مدت 16 تا 18 ساعت (یا یک شبه) → فاز بخار مخزن نیتروژن مایع برای ذخیره سازی طولانی مدت قرار می گیرد.
(6) روش ذخیره سازی انجماد 2: لوله انجماد در یک دستگاه خنک کننده با سرعت ثابت با یک برنامه تنظیم شده قرار می گیرد و سپس در یک مخزن نیتروژن مایع قرار می گیرد.
英语
阿拉伯语
��������